Material Studenti - Experimente Pancreas

Description
eperimente pancreas

Please download to get full document.

View again

of 9
All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.
Information
Category:

Documents

Publish on:

Views: 0 | Pages: 9

Extension: DOCX | Download: 0

Share
Transcript
  MATERIAL STUDENTI Recoltarea sucului pancreatic Recoltarea experimentală : Se realizează fistule pancreatice permanente, pentru a recolta sucul pancreatic direct din canalul Wirsung. Recoltarea sucului pancreatic la om:  În mod curent, sucul pancreatic este recoltat prin tubaj duodenal cu sonda Einhorn, introdusă 60  –   70 cm, până în duoden. Prin această metodă se recoltează suc duodenal, care este un amestec de suc gastric, pancreatic, intestinal şi bilă. Pentru a obţine un suc pancreatic cu o   compoziţie cât mai pură se întrebuinţează sonde cu dublu sau triplu lumen (în care componentele au lungimi inegale), permiţând aspiraţia separată a sucului gastric şi a celui duodenal. Tehnicile moderne realizează recoltarea de suc pancreatic prin cateter izarea endoscopică a canalului Wirsung. Se pot folosi metode de stimulare a secreţiei pancreatice cu alimente, secretină, colecistokinină etc.   Dozarea activităţii enzimatice a tripsinei prin metoda Gross -Michaelis Principiul metodei: Cazeina (substrat p roteic) este hidrolizată până la aminoacizi, sub influenţa tripsinei, la temperatură de 37oC. Cazeina nehidrolizată va căpăta un aspect tulbure, prin adăugare de soluţie alcool - acid. Materiale necesare: stativ cu eprubete pipete soluţie NaCl 9‰ produs biologic: suc pancreatic soluţie de cazeină 1‰ soluţie alcool - acid (acid acetic glacial şi alcool) soluţie tampon termostat reglat la 37oC ceas de laborator Tehnica de lucru:  În 10 eprubete se fac diluţii crescânde din lichidul de cercetat (suc pancreatic). Se procedează astfel: în prima eprubetă se pun 2 cm3 de suc pancreatic, în celelalte câte 1 cm3 de soluţie de  NaCl 9‰. Din prima eprubetă se ia 1 cm3 şi se trece în eprubeta  a 2- a, se amestecă, se ia 1 cm3, care se pune în eprubeta a 3- a şi aşa mai departe. Astfel, se obţin diluţii de suc pancreatic, în raport de: 1/1; 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32; 1/64; 1/128; 1/256; 1/512. În fiecare eprubetă se adaugă 2 cm3 de soluţie de cazeină 1‰ (câte 2 mg de cazeină) şi câte 1 cm3 de soluţie tampon (pH = 7,8 - 8). Eprubetele se ţin o oră la 37 oC, pentru a crea enzimei condiţii optime de lucru. După ce se scot eprubetele de la termostat, se adaugă în fiecare câte 2 - 3 picături de alcool - a cid. Se urmăreşte aspectul conţinutului eprubetelor, începând de la prima eprubetă. Se notează ultima eprubetă, al cărei conţinut rămâne încă limpede (în care cantitatea de tripsină a fost suficientă pentru a hidroliza toată cazeina din eprubetă, respectiv   cele 2 mg de cazeină).   Epr ubeta 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 suc pancr eatic 2 cm3 - - - - - - - - - Sol uţie NaCl 9‰ (ser fiziologic) - 1 cm3 1 cm3 1 cm3 1 cm3 1 cm3 1 cm3 1 cm3 1 cm3 1 cm3 Din prima eprubetă se ia 1 cm3 suc pancreatic şi se pune în eprubeta a 2- a, se amestecă şi din acest amestec se ia 1 cm3 şi se trece în eprubeta a 3 - a, ş.a.m.d. sol uţie de cazein ă 1‰ 2 cm3 2 cm3 2 cm3 2 cm3 2 cm3 2 cm3 2 cm3 2 cm3 2 cm3 2 cm3 Sol uţie tampon (pH = 1 cm3 1 cm3 1 cm3 1 cm3 1 cm3 1 cm3 1 cm3 1 cm3 1 cm3 1 cm3  7,8 - 8) Se agită toate eprubetele şi se lasă la termostat, la 37oC, timp de o oră. alcool  –  acid 2  –  3 pic 2  –  3 pic 2  –  3 pic 2  –  3 pic 2  –  3 pic 2  –  3 pic 2  –  3 pic 2  –  3 pic 2  –  3 pic 2  –  3 pic Rezultate: Rezultatul se exprimă în unităţi triptice. Unitatea triptică este cantitatea de enzimă capabilă să hidrolizeze 1 mg de cazeină,  într- o oră, la 37 oC. Exemplu: În eprubeta nr. 4, cantitatea iniţială de 1 cm3 suc pancreatic sau duodenal, a fost diluată la 1/8, hidrolizând 2 mg de cazeină. Tripsina conţinută într  -un cm3 de suc pancreatic nediluat va fi 8 x 2 = 16 unităţi triptice. Dozarea produşilor de   digestie triptică prin metoda Sörensen  Principiul metodei: Dozarea activităţii proteolitice a tripsinei se poate face şi prin dozarea produşilor rezultaţi prin hidroliza proteinelor, până la aminoacizi, realizată prin activitatea enzimei,  în condiţii standard de temperatură (37 oC) şi timp de acţiune.  Aminoacizii sunt substanţe amfotere, deoarece posedă atât funcţie bazică (amino), cât şi funcţie acidă (carboxil). Substanţele amfotere, la punctul izoelectric, disociază în mod egal funcţiile acide, respe ctiv bazice. În mediu mai acid decât punctul izoelectric, disociază funcţia bazică, iar în mediul mai alcalin decât punctul izoelectric, disociază funcţia acidă. Metoda de dozare Sörensen se bazează pe proprietatea generală a aldehidelor de a reacţiona cu  -NH2 (radicalul amino, radical bazic) din molecula aminoacizilor, dând astfel naştere la compuşi numiţi baze Schiff. În acest fel, aminoacidul rămâne numai cu funcţia carboxil liberă, comportându - se ca un acid obişnuit, care disociază doar H+, aciditatea putând fi titrată volumetric, cu soluţie NaOH 0,1N. Tripsina acţionează în mediu alcalin (pH = 8 - 8,8), deci aminoacizii rezultaţi din acţiunea ei se află într  - un astfel de mediu. Înaintea blocării funcţiei amino cu o formaldehidă, trebuie procedat la n eutralizarea mediului; în caz contrar, o parte din funcţiile carboxil ale bazelor Schiff vor reacţiona cu mediul alcalin şi, la titrare, vom găsi o cantitate de acid mai mică decât cea reală. Materiale necesare: lichid de digestie triptică    fenolftaleină sol 1 % formol neutralizat NaOH 0,1N HCl 1% balon Erlenmeyer, biuretă, pipete Tehnica de lucru: Există 3 faze: Faza 1: neutralizarea mediului alcalin.  În balonul Erlenmeyer se pun 5 cm3 lichid de digestie triptică, se adaugă 2 –   3 picături din soluţia de fenolftaleină. Lichidul având o reacţie alcalină, fenolftaleina se colorează în roşu - violet (pH peste 8). Cu o pipetă se adaugă picătură cu picătură HCl 1%, agitând de fiecare dată, până când culoarea roşie a devenit roz palid. Faza 2: legarea funcţiilor amino. Se adaugă acelaşi volum (5 cm3) de aldehidă formică neutralizată 40%, formându -se baze Schiff, aminoacizii transformându-se în acizi. Culoarea roz dispare imediat, fenolftaleina în mediul acid fiind incoloră. Faza 3: titrarea acizilor rezultaţi (baze Schiff). Se titrează cu soluţie NaOH 0,1N picătură cu picătură, până când lichidul din balon îşi recapătă culoarea slab roză. Rezultate: Se exprimă fie în unităţi triptice  în sucul pancreatic, fie în grame de glicocol sau de alanină % sau ‰ (în funcţie de greutatea moleculară a acestor aminoacizi). Unitatea triptică reprezintă (în acest caz) numărul de cm3 de NaOH 0,1N, necesar pentru neutralizarea aminoacizilor (ca baze Schiff), rezultaţi dintr  - o substanţă proteică, digerată timp de o oră la 37oC şi la pH=8, sub influenţa unei cantităţi determinate de suc pancreatic (1 cm3). Cunoscând cantitatea de glicocol sau alanină din cei 5 cm3 lichid de digestie triptică, se poate calcula cantitatea % sau ‰, înmulţindu -se cu 20 sau cu 200. Dozarea activităţii lipolitice prin metoda Carnot –  Mauben Principiul metodei: Se titrează acizii graşi liberi, rezultaţi prin acţiunea lipazei în condiţii standard, cu soluţie NaOH 0,1N, în prezenţa fenolftaleinei. Materiale necesare: suc pancreatic (duodenal ulei de măsline alcool 96o
Related Search
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks