El tratamiento con estatinas mejora las alteraciones ultraestructurales de los vasos oculares en el conejo hipercolesterolémico

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  www.elsevier.es/arterio ORIGINAL El tratamiento con estatinas mejora las alteracionesultraestructurales de los vasos oculares en el conejohipercolesterole´mico Alberto Trivin˜o a , Blanca Rojas a , Ana I. Ramı´rez a , Juan J. Salazar a , Rosa De Hoz a ,Marta Ramajo b , Santiago Redondo b , Jorge Navarro-Dorado b , Teresa Tejerina b yJose M. Ramı´rez a,  a Instituto de Investigaciones Oftalmolo´gicas Ramo´n Castroviejo, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, Espan˜a b Departamento de Farmacologı´a, Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, Espan˜a Recibido el 9 de febrero de 2010; aceptado el 8 de abril de 2010 PALABRAS CLAVE Conejohipercolesterole´mico;Ojo;Microscopı´aelectro´nica Resumen Introduccio´n:  Evaluar los cambios ultraestructurales de los vasos coriorretinianos enconejos hipercolesterole´micos tratados con estatinas. Me´todos:  Se utilizaron conejos New Zealand que fueron divididos en 4 grupos: control(G0; n ¼ 10), conejos alimentados con una dieta esta´ndar durante 8 meses. Grupohipercolesterole´mico (G1, n ¼ 8), conejos alimentados con una dieta enriquecida con 0,5%de colesterol durante 8 meses. Grupo hipercolesterole´mico ma´s Fluvastatina so´dica (G2A,n ¼ 4). Grupo hipercolesterole´mico ma´s Pravastatina so´dica (G2B, n ¼ 4).Grupo estatinas (G2A y B, n ¼ 8), conejos alimentados con una dieta enriquecida con 0,5%de colesterol durante 8 meses ma´s la administracio´n de fluvastatina so´dica o pravastatinaso´dica a una dosis de 2mg/kg/d. Los ojos fueron procesados para microscopı´a electro´nicade trasmisio´n. Resultados:  G1 tenı´a una gran cantidad de lı´pidos en la supracoroides que comprimı´an las capas vasculares coroideas. En G2 las ce´lulas espumosas y los lı´pidos de la supracoroides yde las capas vasculares coroideas habı´an disminuido de forma considerable, aunque habı´ama´s fibras de cola´geno. Las luces de los vasos coroideos estaban ma´s abiertas en G2 que enG1, estando en estos u´ltimos casi colapsadas debido a la compresio´n y a la hipertrofia delas ce´lulas musculares lisas y de las ce´lulas endoteliales. La apariencia normal delendotelio vascular en G2 contrastaba con la necrosis observada en G1. En G2 el espesor dela membrana de Bruch y de las membranas basales de los vasos retinianos y coroideosestaba reducido en comparacio´n con G1. 0214-9168/$-see front matter  &  2010 Elsevier Espan˜a, S.L. y SEA. Todos los derechos reservados.doi:10.1016/j.arteri.2010.04.007  Autor para correspondencia. Correo electro´nico:  ramirezs@med.ucm.es (J.M. Ramı´rez).Clin Invest Arterioscl. 2010; 22(4) :127 – 135 Documento descargado de http://www.elsevier.es el 18/09/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.  Conclusiones:  El tratamiento con estatinas reduce la cantidad de lı´pidos y de macro´fagosde la coroides. Adema´s, protege a las ce´lulas endoteliales y mantiene abiertas las luces delos vasos coroideos. &  2010 Elsevier Espan˜a, S.L. y SEA. Todos los derechos reservados. KEYWORDS Cholesterol-fedrabbit;Eye;Electron microscopy Treatment with statins improves the ultrastructural changes of the ocular vessels inhypercholesterolemic rabbitsAbstract Introduction:  To evaluate the ultra-structural changes of the chorioretinal vessels inhypercholesterolemic rabbits after treatment with statins. Methods:  New Zealand rabbits were divided into four groups: Control (G0;  n ¼ 10), and feda standard diet for 8 months; Hypercholesterolemic (G1,  n ¼ 8), were fed a 0.5%cholesterol-enriched diet for 8 months. Statins group (G2A y B,  n ¼ 8), were each fed a 0.5%cholesterol-enriched diet for 8 months plus administration of fluvastatin sodium (G2A) orpravastatin sodium (G2B) at a dose of 2mg/Kg/day. Eyes were processed by transmissionelectron microscopy. Results:  G1 had a buildup of lipids at the suprachoroidea that compressed the vascularlayers. G2 had a substantial decrease in the number of foam cells and lipids but morecollagen fibres in the suprachoroidea and vascular layers. The lumen of the choroidalvessels was opened more in G2 in comparison with G1, which had a reduction in thecapillary lumen to the point of collapse due to compression and hypertrophy of endothelialand vascular smooth muscle cells. The normal appearance of endothelial cells in G2 was incontrast with the endothelial necrosis observed in G1. In G2, the thickness of the Bruchmembrane and the basal membrane of the choroidal and retinal vessels were reduced incomparison with G1. Conclusions:  Treatment with statins reduces the build up of lipids and the number of macrophages in the choroid. Additionally, they preserve the endothelial cells and open thevascular lumens of choroidal vessels. &  2010 Elsevier Espan˜a, S.L. and SEA. All rights reserved. Introduccio´n Las enfermedades cro´nicas son la principal causa de muerteen los paı´ses desarrollados, constituyendo su problema desalud ma´s prevalente y el srcen de la mayor parte de lasdiscapacidades y por consiguiente, de las necesidadesasistenciales de los individuos que las padecen. En estesentido, y en relacio´n con los problemas oculares en elmundo occidental, los casos de ceguera en la edad adultaobedecen a la retinopatı´a diabe´tica y las enfermedades delnervio o´ptico; y entre los mayores, a la degeneracio´nmacular asociada a la edad (DMAE), el glaucoma y lacatarata.Todas las enfermedades cro´nicas se hallan vinculadas adeterminados factores de riesgo, siendo de gran intere´sconocer su magnitud y evolucio´n, en especial para los decara´cter modificable, por ser el objetivo principal de lasestrategias preventivas.Los estudios epidemiolo´gicos muestran una asociacio´nentre las lesiones vasculares retinianas y la incidencia delesiones a otro nivel que parecen estar ligadas, ma´s que a laslesiones macrovasculares, a factores comunes de afectacio´nmicrovascular, cuyo papel, tanto en la cardiopatı´a isque´micacomo en el ictus, podrı´a ser mayor del sospechado.Son bien conocidas las consecuencias de la hipercoleste-rolemia en la cardiopatı´a isque´mica y la patologı´a cere-brovascular, pero no ocurre lo mismo con las repercusionesfuncionales que de ella se derivan a nivel ocular, entre otrascosas, porque tampoco son muy conocidos los cambiosestructurales a que puede dar lugar. Estudios clı´nicos hansugerido que la hiperlipemia, por sı´ misma, podrı´a generarcambios estructurales en el sistema vascular coroideo yretiniano que secundariamente con el tiempo, podrı´an srcinar disfuncio´n retiniana 1,2 .En recientes trabajos se ha demostrado la posible relacio´nentre la degeneracio´n DMAE, la principal causa de cegueraen mayores de 65 an˜os en los paı´ses industrializados, y losniveles altos de colesterol 3,4 . Adema´s, durante los u´ltimos10 an˜os se han sen˜alado los beneficios del uso de fa´rmacoshipolipemiantes para disminuir el riesgo de desarrollar unaDMAE 5 . Entre ellas, destacan las que adema´s de reducir losniveles de colesterol, poseen la capacidad de mejorar lafuncio´n vascular 6 .La retina de los mamı´feros posee una doble vasculariza-cio´n: la retiniana propiamente dicha y la derivada de losvasos coroideos. La coroides es un tejido vascular situadoentre la esclera y la retina. La supracoroides la separade la esclera y la membrana de Bruch, una estructuraformada fundamentalmente por tejido ela´stico y cola´geno lasepara de la retina externa avascular. La coroides esta´formada por vasos de calibre decreciente desde la capa degrandes vasos, junto a la supracoroides, hasta la coriocapilarformada por capilares fenestrados adyacentes a la mem-brana de Bruch.A. Trivin˜o et al128 Documento descargado de http://www.elsevier.es el 18/09/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.  El objetivo del presente trabajo fue demostrar, en unmodelo experimental de conejos hiperlipe´micos, co´mo eluso de estatinas puede disminuir las alteraciones vascularesoculares. Con ese fin se analizo´ la ultraestructura de lacoroides y la retina en dichos animales. Material y me´todos Animales de experimentacio´n Para la realizacio´n de este trabajo se utilizaron comoanimales de experimentacio´n 26 conejos machos  New Zealand White,  de 2,5 7 0,5kg de peso (3 meses de edad).Los animales, suministrados por Biocentre S.A. (Barcelona,Espan˜a), fueron mantenidos en jaulas individuales y en unahabitacio´n acondicionada bajo un ciclo de luz-oscuridad de12h. Todos los conejos fueron alimentados con una dietaesta´ndar (Panlab S.L. Barcelona, Espan˜a) durante al menos 7dı´as antes de comenzar el experimento. El agua estabadisponible  ) ad libitum *  y la ingestio´n de alimentos fuemonitorizada diariamente en todos los grupos.Los animales se subdividieron en 4 grupos: grupo control(G0, n ¼ 10), alimentado con una dieta esta´ndar durante 8meses, tras los cuales fueron sacrificados; grupo hipercoles-terole´mico (G1, n ¼ 8) alimentados con una dieta esta´ndarenriquecida con 0,5% de colesterol (UAR, Parı´s, Francia)durante 8 meses; grupo estatinas (G2Ay B, n ¼ 8) alimentadoscon una dieta esta´ndar enriquecida con 0,5% de colesterol(UAR, Parı´s, Francia) ma´s la administracio´n de Fluvastatinaso´dica (G2A, n ¼ 4) (Novartis; Farmaceu´tica, Barcelona,Espan˜a) o Pravastatina so´dica (G2B, n ¼ 4) (Bristol-MyersSquibb, Madrid, Espan˜a), a la dosis de 2mg/kg/d durante 8meses siendo sacrificados tras dicho periodo de tiempo.El peso de los animales se determino´ antes de comenzarel tratamiento y posteriormente una vez al mes durante elestudio. El consumo de la dieta fue controlado diariamente.Al comienzo del experimento y 1 vez al mes hasta lafinalizacio´n del mismo, se tomaron muestras de sangre de lavena marginal de la oreja para determinar las concentra-ciones sanguı´neas de colesterol total, lipoproteı´nas de altadensidad (HDL) y lipoproteı´nas de baja densidad (LDL).Dicha cuantificacio´n se realizo´ mediante una reaccio´ncolorime´trica utilizando un equipo enzima´tico comercial(BioMerieux, Francia) (tabla 1).Todos los experimentos fueron aprobados por el comite´para la experimentacio´n animal (CEA) de la UniversidadComplutense, de acuerdo con el Real Decreto 223/198 sobreproteccio´n de los animales utilizados para experimentacio´ny otros fines cientı´ficos. Fijacio´n y procesamiento de los tejidos Los animales fueron anestesiados con pentobarbital so´dico(25mg/kg i.v.) y perfundidos a trave´s de la caro´tida internacon glutaraldehido al 2% en tampo´n fosfato 0,1M pH 7,4.Tras el sacrificio de los animales se extrajeron los globosoculares. Inmediatamente tras la extraccio´n se elimino´ laco´rnea y el cristalino y se fijaron por inmersio´n durante 5hen glutaraldehido al 2% en tampo´n fosfato 0,1M pH 7,4 a4 1 C. A continuacio´n, los globos oculares se lavaron entampo´n fosfato 0,1M y se cortaron en piezas muy pequen˜asque incluı´an esclera, coroides y retina para su estudio amicroscopı´a electro´nica. Los fragmentos fueron posfijadosen tetro´xido de osmio en tampo´n fosfato 0,1M durante 2h a4 1 C. Las piezas se deshidrataron en acetonas de concen-tracio´n creciente y finalmente fueron incluidas en araldita.Una vez tallados los bloques, se procesaron para larealizacio´n de cortes semifinos y finos mediante el ultrami-crotomo Reichert OM-V3 (Leica Microsystem, Alemania). Loscortes semifinos se tin˜eron con azul de toluidina. Los cortesfinos fueron contrastados con acetato de uranilo y citrato deplomo, para su posterior observacio´n en el MicroscopioElectro´nico ZEISS 902 del Centro de Microscopı´a Electro´nica ) Luis Bru´ *  de la Universidad Complutense de Madrid. Resultados Los conejos hipercolesterole´micos (G1) presentaban unosaltos niveles plasma´ticos de lı´pidos con respecto al grupocontrol (G0). Los animales tratados con estatinas (G2A y B)presentaban unos niveles plasma´ticos de lı´pidos semejantesa los del grupo hipercolesterole´mico (G1) (tabla 1).En los animales tratados con estatinas (fluvastatina so´dicay pravastatina so´dica) los hallazgos encontrados fueronsimilares. Por este motivo, los resultados de este grupo deestudio se describen de forma conjunta. Ultraestructura de la coroides Supracoroides En los conejos del grupo G1 (hipercolesterole´micos) la zonade transicio´n entre esclera y la capa vascular coroidea sufrio´grandes cambios con respecto al grupo G0 (control). Lasupracoroides mostraba una gran distensio´n debido alacu´mulo de lı´pidos. Se observa una gran cantidad de ce´lulasespumosas en cuyo citoplasma se acumula una gran cantidadde lı´pidos. Entre las ce´lulas se observan fibras de cola´geno ycristales de colesterol (fig. 1A). Sin embargo en los animalestratados con estatinas (G2A y B, experimentales) en generalhabı´a menos lı´pidos en esta capa, observa´ndose escasas Tabla 1  Valores se´ricos de lı´pidos en los grupos de estudioG0 (mg/100ml) G1 (mg/100ml) G2A (mg/100ml) G2B (mg/100ml)Colesterol 43 7 15 1.466 7 281 1.259 7 380 1.151 7 281Triglice´ridos 167 7 46 278 7 67 288 7 118 170 7 81 G0: Control (n ¼ 10); G1: Grupo hipercolesterole´mico (n ¼ 8) alimentados con una dieta esta´ndar enriquecida con 0,5% de colesterol;G2: Grupo estatinas (n ¼ 8) alimentados con una dieta esta´ndar enriquecida con 0,5% de colesterol ma´s la administracio´n deFluvastatina so´dica (G2A, n ¼ 4) o Pravastatina so´dica (G2B, n ¼ 4). Prevencio´n progresio´n aterosclerosis en vasos corioideos y retinianos por estatinas 129 Documento descargado de http://www.elsevier.es el 18/09/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.  ce´lulas espumosas y pocos cristales de colesterol. Dichoshallazgos contribuı´an a una menor distensio´n de este espacioy por lo tanto, a una menor compresio´n de las capasvasculares de la coroides (fig. 1B). Este acu´mulo en el G1 ejercı´a un desplazamiento de las estructuras vecinas que setraducı´a en una compresio´n de los espacios supracoroideoscontra la esclera y un rechazo de toda la capa vascular de lacoroides contra la membrana de Bruch (fig. 2B).En los conejos del G1 en la supracoroides y cerca de lazona de los grandes vasos coroideos, se apreciabala existencia de ce´lulas que por las caracterı´sticas de lacromatina nuclear y el contenido de su citoplasma, podrı´ancorresponder a macro´fagos cargados de lı´pidos (ce´lulasespumosas) (fig. 1A). Entre estas ce´lulas se observaronfibrillas de cola´geno que se agrupaban formando lamelas y Figura 1  Microscopı´a electro´nica de la supracoroides.A) conejos hipercolesterole´micos. Se observa una gran cantidadde ce´lulas espumosas (flechas) en cuyo citoplasma se acumulauna gran cantidad de lı´pidos. Entre las ce´lulas se observan fibrasde cola´geno y cristales de colesterol (cabeza de flecha). B) Enlos animales tratados con estatinas, disminuyen las ce´lulasespumosas y los lı´pidos se localizan principalmente dentro delos fibroblastos (F). (L: lı´pidos; C: cola´geno) (B: animal tratadocon Fluvastatina so´dica). Barra: 10 m m. Figura 2  Microscopı´a electro´nica de las capas de los grandesvasos, vasos medianos y coriocapilar. A) Estructura esponjosa dela coroides en los animales control. B) En el grupo de conejoshipercolesterole´micos las luces de los vasos sanguı´neos esta´nreducidas hasta el punto de colapsarse en algunas zonas. C) Enlos animales tratados con estatinas las luces vasculares esta´nabiertas. (CC: coriocapilar; CV: capa de grandes vasos ymedianos; EPR: epitelio pigmentario de la retina; L: lı´pidos;MB: membrana de Bruch; SC: supracoroides. (C: animal tratadocon Fluvastatina so´dica). Barra: 10 m m. A. Trivin˜o et al130 Documento descargado de http://www.elsevier.es el 18/09/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.  fibras ela´sticas. Adema´s, habı´a estructuras alargadas, ma´s omenos fusiformes y perfectamente delimitadas, que podrı´ancorresponderse con cristales de colesterol (fig. 1A). Capa de vasos grandes y medianos En los conejos del G1 estos vasos presentaban un granestrechamiento de su luz, que era irregular y estaba totalmentecolapsada en algunas zonas (figs. 2B y 3B). Mientras que en losanimales tratados con estatinas (G2A y B) las luces vasculareseran semejantes a las del GO (figs. 2C y 3A,C), ası´ las luces vasculares esta´n abiertas (fig. 2C y 3C). En los animales del G1se encontro´ que algunas ce´lulas endoteliales y muscularesestaban hipertrofiadas mientras que otras estaban necro´ticas ycontenı´an material lipı´dico. Sin embargo en los animalestratados con estatinas (G2A y B) el endotelio se encontrabamuy conservado desapareciendo los signos de necrosis casi porcompleto (fig. 3C). Las ce´lulas musculares estaban muyparecidas a las del G0 aunque se apreciaba alguna inclusio´nde lı´pidos (fig. 3A,C). En la adventicia los lı´pidos habı´an disminuido con respecto al grupo G1, observa´ndose, sinembargo, una mayor cantidad de fibras de cola´geno que en elG0 (fig. 3A,C) las luces vasculares, las musculares lisas, lasendoteliales y la membrana basal eran ma´s parecidas a las delgrupo control que a la de los animales hipercolesterole´micos(fig. 3A – C). En el G1 la membrana basal estaba engrosada,presentando lı´pidos en su interior (fig. 3B). En este grupo en el espacio intervascular, tambie´n se apreciaba mayor contenido encola´geno y fibroblastos ası´ como la presencia de ce´lulasespumosas (figs. 2B y 3B). Coriocapilar En el G1 en general la coriocapilar estaba completamenterechazada contra la membrana de Bruch, con las lucesvasculares muy estrechadas y en ocasiones obliteradas(fig. 2B). Muchas ce´lulas endoteliales estaban necro´ticas,mientras que otras presentan rarefacciones que contribuı´ana la reduccio´n del lumen vascular (fig. 4B). En los animalestratados con estatinas (G2A y B) las luces de los capilaresestaban abiertas y el endotelio de la coriocapilar nopresenta signos de necrosis (fig. 4C). Membrana de Bruch Se observaba un aumento generalizado de su espesor conrespecto al grupo control debido, fundamentalmente, alacumulo de lı´pidos (fig. 4A,B). En los animales tratados con estatinas (G2A y B) el espesor de la membrana de Bruch erasimilar al control debido fundamentalmente a la grandisminucio´n de los lı´pidos. Sin embargo, el taman˜o de lasfibras de cola´geno era mayor (fig. 4A,C). Ultraestructura de la retina Tanto los vasos localizados en la capa de fibras del nervioo´ptico (FNO) como los situados a nivel del vı´treo no Figura 3  Microscopı´a electro´nica de las capas de los grandesvasos y vasos medianos. A) Animales control. B) En los conejoshipercolesterole´micos las luces vasculares esta´n estrechadas, seobserva la hipertrofia de las ce´lulas musculares lisas y necrosis ohipertrofia de las ce´lulas endoteliales. La membrana basal esta´engrosada. C) En los animales tratados con estatinas las lucesvasculares, las musculares lisas, las endoteliales y la membranabasal eran ma´s parecidas a las del grupo control que a la de losanimales hipercolesterole´micos. (C: cola´geno; E: ce´lula endo-telial; M: ce´lula muscular lisa; mb: membrana basal; L: luzvascular; *: Lı´pido). (C: animal tratado con Fluvastatina so´dica).Barra: 5 m m. Prevencio´n progresio´n aterosclerosis en vasos corioideos y retinianos por estatinas 131 Documento descargado de http://www.elsevier.es el 18/09/2016. Copia para uso personal, se prohíbe la transmisión de este documento por cualquier medio o formato.
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